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EN1（Engrailed 1）抗體（N-term）

親和純化兔多克隆抗體 (Pab)

用 EN1 Antibody (N-term) (Cat#AP7278a) 染色的 U251 細(xì)胞的熒光圖像。用 4% PFA 固定 U251 細(xì)胞（20 分鐘），用 Triton X-100 透化（0.1%，10 分鐘），然后用EN1 一抗（1:25，37℃ 1 h）。二抗使用 Alexa Fluor® 488 偶聯(lián)驢抗兔抗體（綠色）（1:400，37℃ 50 分鐘）。細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白用 Alexa Fluor® 555（紅色）偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽（7units/ml， 1 h at 37℃)。EN1免疫反應(yīng)性明顯定位于Nucleus。

產(chǎn)品信息

應(yīng)用     IF、IHC-P、WB、E

初次加入       Q05925

反應(yīng)性    人類(lèi), 老鼠

主持人    兔子

克隆性    多克隆

同型       兔免疫球蛋白

計(jì)算的 MW   40115 大

抗原區(qū)    1-30個(gè)氨基酸

附加信息

基因識(shí)別       2019

其他名稱(chēng)       Homeobox protein engrailed-1, Homeobox protein en-1, Hu-En-1, EN1

目標(biāo)/特異性  這種 EN1 (Engrailed 1) 抗體由用人 EN1 (Engrailed 1) N 末端區(qū)域 1-30 個(gè)氨基酸之間的 KLH 偶聯(lián)合成肽免疫的兔子產(chǎn)生。

稀釋       IF~~1:25

WB~~1:2000

IHC-P~~1:25

格式       含有 0.09% (W/V) 的 PBS 中純化的多克隆抗體。該抗體通過(guò)蛋白 A 柱純化，然后進(jìn)行肽親和純化。

貯存       在 2-8°C 下冷藏長(zhǎng)達(dá) 2 周。如需長(zhǎng)期儲(chǔ)存，請(qǐng)以小等份在 -20°C 下儲(chǔ)存，以防止凍融循環(huán)。

防范措施       EN1 (Engrailed 1) Antibody (N-term) 僅供研究使用，不得用于診斷或治療程序。

蛋白質(zhì)信息

姓名       EN1

功能       需要正確形成頂端外胚層脊和正確的肢體背腹模式。

蜂窩定位       核。

A. 細(xì)胞溶解劑的制備。采用胰蛋白酶消化法和旋轉(zhuǎn)法收集細(xì)胞(匯合 t-25)。用100 ul 溶解緩沖液溶解球10分鐘。500,000細(xì)胞，lyze with 20 ul. 3。轉(zhuǎn)速14000轉(zhuǎn)/分(16000克) ，在4 ° c 下微加速10min。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中，然后丟棄小球。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(bradford 法，a280，或 bca)(我們使用 bio-rad 的 bradford 法)圖6。取 x ul (= y ug 蛋白質(zhì)) ，與 x ulof 2倍的樣品緩沖液混合。煮5分鐘，冷卻5分鐘。8?？焖傩D(zhuǎn)降低凝結(jié)，加載凝膠 b。聚丙烯酰胺凝膠(14.5 cm × 16.5 cm)1。瓊脂糖塞: 1% 瓊脂糖溶于1 × 分解膠體緩沖液中。(我做50毫升，需要的時(shí)候就繼續(xù)融化，然后再加水來(lái)保持瓊脂二。)圖2。凝膠: 24毫升9% 凝膠5.4毫升40% 丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(29:1的混合物)3毫升8x 分辨凝膠緩沖劑15.6毫升水12ul temed60 ul 20% 過(guò)硫酸銨3。堆疊凝膠: 8毫升40% 丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(29:1的混合物)2毫升4 × 堆疊凝膠緩沖劑5毫升水8 u l/d 21.6 u l/20% 過(guò)硫酸銨

C. 凝膠的制備。組裝玻璃板和隔板(1.5毫米厚)。倒入瓊脂糖塞子(1-2毫米)。將流動(dòng)凝膠倒入梳子孔下約1厘米處(約20毫升)。用1ml 水飽和正丁醇密封。(可以在這里停下來(lái)，如果你愿意的話，可以把這個(gè)膠留在這里。)5.凝膠凝固后，倒出丁醇，用去離子水沖洗。倒入堆積凝膠(約5毫升) ，立即插入組織塊。凝膠凝固后，放入明膠中浸泡。8。在運(yùn)行凝膠之前，用運(yùn)行緩沖器*沖洗油井。運(yùn)行 gel1。在快速旋轉(zhuǎn)樣品后，裝入井中。2。記得用記號(hào)筆。我們直接使用15號(hào) ulbio-rad kaleidoscope 標(biāo)準(zhǔn) # 161-0324。在恒定電流(35-37ma，電壓設(shè)置大于150v)下運(yùn)行。4。通常播放時(shí)間是1.3小時(shí)。使用預(yù)制凝膠(來(lái)自 bio-rad 的預(yù)制凝膠)1。在凝膠裝置中組裝凝膠2。準(zhǔn)備蛋白質(zhì)樣品(10微克就夠了)。

圖3。使用5ul 的萬(wàn)花筒標(biāo)準(zhǔn)。在200v (恒定電壓)下運(yùn)行30min.f。膜制劑。切一塊 pvdf 薄膜(milliporeimmobilon-p # ipvh 00010)。2。在搖床上浸入甲醇5分鐘。去除甲醇，加入1xtransfer buffer 直到可以使用。膜轉(zhuǎn)移。為 bio-rad‘ stransblot 組裝"三明治"2。預(yù)濕海綿，濾紙(略大于凝膠)在1 × 吸水緩沖器。海綿-濾紙-凝膠-濾膜-濾紙-海綿。轉(zhuǎn)移1小時(shí)15伏，在4 ° c 的攪拌板上。更大的蛋白質(zhì)可能需要更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移時(shí)間。對(duì)于迷你傳輸，100v1小時(shí)，加上冷敷和緩沖液。4。用氨基黑染色法浸泡膜5分鐘。用脫色緩沖液固定4 × 5分鐘。完成后，在室溫下浸泡隔膜一小時(shí)?？贵w和檢測(cè)。在室溫條件下，與一級(jí)抗體稀釋至2ug/ml，總體積為3ml 的阻滯緩沖液中孵育1小時(shí)。用0.05% 吐溫20焦清洗4 × 5分鐘。與二級(jí)抗體1:10,000(hrpoanti-rabbit)在阻滯緩沖液中培養(yǎng)1小時(shí)，室溫4。用0.05% 吐溫20毫升洗滌4 × 5分鐘。用皮爾斯化學(xué)發(fā)光試劑盒(prod # 34080)檢測(cè)。

I 剝除斑點(diǎn)1。用0.05% 的吐溫20在 pbs 上沖洗污漬。2。把污漬放進(jìn)卡帕克袋子里，切成略大于污漬的大小。3。加入大約5至10毫升的剝離緩沖液。盡可能多地排除空氣和密封袋。5。浸泡在80 °c 水浴中20分鐘。用0.05% 的吐溫20在 pbs 上清洗污漬。7。用5% bsa/tween20阻滯約1小時(shí)，或用3% bsa/tween20阻滯一夜。用于維斯特斯裂解緩沖液的緩沖液: 0.15 m nacl5毫米 edta，ph 值81% triton x10010毫米 tris-cl，ph 值7.4，使用前添加: 1:10005 m dtt1:1000100毫米 pmsf 在異丙醇中1:10005 m ε-aminocatacid2x 樣品緩沖液: 130毫米 tris-cl,ph8.020% (v/v)甘油4.6% (w/v) sds0.02% 溴苯酚藍(lán)2% dtt8x 分辨凝膠緩沖液: 100 ml0.8 g sds (最后加入)36.3 g trizma 堿(= 3 m)用濃縮 hcl4x 凝膠緩沖液: 100 ml 調(diào)整 ph 為8.80.4 g sds (最后加入)6.05 g trizma base (= 0.5 m)調(diào)整 ph 值為6.810 x 運(yùn)行緩沖液: 1 l30.3 g trizma base (= 0.25 m)144 g 甘氨酸(= 1.92 m)10 g sds (= 1%) -- 最后加入

不要調(diào)整 ph 值! ！10x 吸墨緩沖液: 1 l30.3 g trizma base (= 0.25 m)144 g 甘氨酸(= 1.92 m) ph 值應(yīng)為8.3;。為防止細(xì)菌污染，將緩沖液剝離: 0.5 l (無(wú)菌過(guò)濾液，保持在4 °c)0.2 m 甘氨酸，ph 值2.50.05% 吐溫20

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