服務(wù)熱線
15201163601
-
recipe 抗原蛋白 P9 ; 間接 ELISA 試驗(yàn)操作
發(fā)布時(shí)間： 2024-02-19 點(diǎn)擊次數(shù)： 799次北京華新康信年度推廣活動(dòng) RECIPE 上海試劑 RECIPE 湖北試劑 RECIPE 10280血漿對(duì)照 RECIPE 10280血漿對(duì)照
RECIPE 活動(dòng)價(jià)RECIPE 活動(dòng)價(jià)RECIPE 活動(dòng)價(jià) RECIPE 所有系列一站式采購 RECIPE 檢測(cè)試劑盒 RECIPE 檢測(cè)試劑盒 RECIPE 放線菌類 RECIPE 放線菌類胰蛋白 RECIPE 江蘇試劑 RECIPE 湖南試劑 RECIPE 所有系列一站式采購RECIPE 天津試劑 RECIPE 所有系列一站式采購 RECIPE 天津試劑 RECIPE 天津試劑 RECIPE 上海試劑 RECIPE 上海試劑 RECIPE 廣東試劑 RECIPE 廣東試劑
抗原蛋白 P9 ; 間接 ELISA
1 材料與方法
1. 1 菌株及血清 副雞禽桿菌 A、B、C 三個(gè)血清型
的標(biāo)準(zhǔn)株由本實(shí)驗(yàn)室保存。Apg 的 A 型菌、B 型菌
和 C 型單因子雞血清和 P9 蛋白抗血清分別由對(duì)應(yīng)
菌株或抗原人工接種 SPF 雞制得， 由本實(shí)驗(yàn)室制備
并保存。大腸桿菌 O1、O2、O78亞型以及流感( AI)
H9 亞型、新城疫( ND) LaSota 株( NDLa) 和 F48 株
( NDf48) 、雞傳染性法氏囊病 ( IBD) 、減蛋綜合征
( EDS'76) 等禽病病原單因子陽性雞血清及 SPF 雞
血清等， 均由本實(shí)驗(yàn)室保存或制備， 支原體抗 MG-S6
株陽性血清購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。120 份臨床
樣本血清采自河北某蛋雞場(chǎng) 120 日齡雞， 該雞群分
別在 56 日齡和 90 日齡用雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫
苗進(jìn)行了免疫。
紅細(xì)胞凝集反應(yīng)用抗原( HA 抗原) : 副雞禽桿
菌 A 型( Hp8 株) 、B 型( BJ 株) 和 C 型( 668 株) HA
抗原， HA 效價(jià)均為 1∶ 160; 副雞禽桿菌 A 型陽性血
清、B 型陽性血清和 C 型陽性血清， 紅細(xì)胞凝集抑
制( HI) 抗體價(jià)為 1∶ 80 ～ 1∶ 160; 10% 戊二醛固定的
雞醛化紅細(xì)胞， 以及血清稀釋液( 含 0. 1% BSA 的
0. 01 mol /L pH 值 7. 0 PBS) ， 以上材料均由本實(shí)驗(yàn)
室制備并保存。
1. 2 主要試劑和儀器 酶標(biāo)板為 NUNC 公司產(chǎn)
品， HＲP 標(biāo)記兔抗雞 IgG 抗體產(chǎn)自 Sigma 公司; TMB
顯色液產(chǎn)自 KPL 公司; 酶標(biāo)儀( Molecular Devices，
SPECTＲA MAX190) 。
1. 3 方法
1. 3. 1 抗原蛋白 P9 的制備及純化 利用生物信息
學(xué)軟件 Geneious( Biomatters. Ltd，
， 通 過 對(duì) 副 雞 禽 桿 菌 外 膜 蛋 白
HMTp210 的基因( GenBank No． KJ867497) 篩選分
析， 選取氨基酸序列從第 1090 到 1648 的肽段， 命名
為 P9， 由華大基因科技( 北京) 服務(wù)有限公司進(jìn)行全
基因合成并原核表達(dá)。通過對(duì) P9 編碼基因的 PCＲ
擴(kuò)增、與表達(dá)載體 pET30a 連接等步驟構(gòu)建重組表
達(dá) 質(zhì) 粒 pET30a-P9。 將 pET30a-P9 轉(zhuǎn) 化 BL21
( DE3) ， 誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解上清用鎳親和層析柱
純化， 獲得純化的 P9 蛋白。
1. 3. 2 陰性血清及 P9 蛋白抗血清的制備 重組抗
原蛋白 P9 與 MONTANIDE ISA 71 VG 佐劑( SEPPIC
公司產(chǎn)品) 按 3 ∶ 7 重 量 比 混 合 乳 化 ( 操作方法見
SEPPIC 公司產(chǎn)品使用方法介紹) ， 使疫苗中抗原蛋
白終濃度為 20 μg /mL， 所制備的疫苗命名為 vP9。
免疫方法: 取 42 日齡 SPF 雞， 分為 2 組， 30 只 /組。
其中一組為疫苗免疫組， 分別胸部注射所述 vP9 疫
苗 0. 5 mL /只; 另一組為非免疫對(duì)照組。第 1 次免
疫后間隔 4 周， 對(duì)所有免疫組的雞進(jìn)行二次免疫， 劑
量及免疫途徑與次免疫相同。所有試驗(yàn)雞每周
于翅靜脈采血 1 次， 分離血清， － 20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>
1. 3. 3 間接 ELISA 方法的建立
1. 3. 3. 1 抗原包被濃度及血清稀釋度的選擇 采
用棋盤滴定法， 用 0. 05 mol /L 碳酸鹽緩沖液( PBS，
pH 值 9. 6) 依次按以下比例稀釋 P9 抗原( 0. 5 mg /
mL) : 依次做 50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、
16 000 倍稀釋， 包被反應(yīng)板 100 μL /孔， 橫向包被酶
標(biāo)板， 4 ℃ 過夜; PBST ( PBS + 1% tween20， pH 值
7. 4) 清洗 3 遍后加入封閉液 ( 5% 脫脂乳， PBS 配
制) ， 37 ℃ 封閉 2 h， PBST 清洗 3 遍。陽性血清及陰
性血清 分 別 用 稀 釋 液 ( 1% 脫脂乳， PBS 配制) 從
1∶ 50 進(jìn)行倍比稀釋( 1∶ 50 ～ 1∶ 400) ， 100 μL /孔， 縱
向加入封閉后的抗原包被板中， 其余試驗(yàn)步驟均按
ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)副雞禽桿菌陽性血
清值 OD450 nm值為 1. 0 左右， 陰性 OD450 nm值設(shè)為 0. 1
左右的范圍選擇 P /N 值最大為最佳稀釋條件。
1. 3. 3. 2 最佳血清抗體孵育時(shí)間篩選 將血清用
稀釋液稀釋至相應(yīng)濃度后加入抗原包被板， 100 μL /
孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h、2 h， 其余試驗(yàn)步驟均
按 ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果選擇 P /N 值最大為最
佳孵育時(shí)間。
1. 3. 3. 3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度及時(shí)間確定 完
成血清孵育并清洗后， 以稀釋液分別稀釋 HＲP 標(biāo)記
兔抗雞 IgG 抗體至 1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 20 000，
100 μL /孔， 分別 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h， 其余試驗(yàn)步
驟均按 ELISA 方法進(jìn)行， 試驗(yàn)結(jié)果選擇 P /N 值最大
為最佳條件。
1. 3. 3. 4 顯色時(shí)間確定 酶標(biāo)二抗孵育結(jié)束并清
洗后， 加入 TMB 顯色液， 100 μL /孔， 放置于 37 ℃ 孵
育 5、10、15、20 min 后加入 2 mol /L H2 SO4 終止讀
數(shù)， 50 μL /孔。選擇 P /N 值最大時(shí)最佳顯色時(shí)間。
1. 3. 4 臨界值的確定 在優(yōu)化間接 ELISA 的最佳
條件后， 使用該方法對(duì) 30 份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)， 根
據(jù)檢測(cè)樣品的 OD450 nm 值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)定該間
接 ELISA 方法的判定值: !X + 3 s; 待檢樣品 的
OD
450 nm值若大于判定值， 則該樣品為陽性， 反之， 則
判為陰性。
1. 3. 5 交叉反應(yīng)性試驗(yàn) 采用標(biāo)記為 Hp8( A 型) 、
0221( A 型) 、0083( A 型) 、0222( B 型) 、BJ( B 型) 、
668( C 型) 、Modesto( C 型) 等不同血清型副雞禽桿
菌分別單獨(dú)感染的雞血清作為待測(cè)陽性血清， 未經(jīng)
免疫的 SPF 雞血清為陰性血清， 各個(gè)血清樣本做 3
個(gè)平行重復(fù)測(cè)試， 用于評(píng)價(jià)本方法的交叉反應(yīng)性。
1. 3. 6 特異性檢驗(yàn) 應(yīng)用已建立的間接 ELISA 方
法， 對(duì)常見的大腸桿菌 O1、O2、O78 株， 流感( AI)
H9 亞型、新城疫 ( ND) LaSota 株 ( NDla) 和 F48 株
( NDf48) 、減蛋綜合征( EDS'76) 、雞毒支原體 MG-S6
等禽病病原的陽性血清進(jìn)行檢測(cè)， 并以標(biāo)準(zhǔn)副雞禽
桿菌陽性血清為陽性對(duì)照， 測(cè)定 OD450 nm 值， 各個(gè)血
清樣本做 3 個(gè)平行重復(fù)測(cè)試， 確定該方法的特異性。
1. 3. 7 ELISA 方法檢測(cè)田間血清樣品 本試驗(yàn)建
立的 ELISA 方法， 對(duì)所收集的臨床免疫雞血清， 進(jìn)
行測(cè)定。各個(gè)血清樣本做 3 個(gè)平行重復(fù)， 計(jì)算 OD
值， 并依照本試驗(yàn)所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)判定檢測(cè)結(jié)果。
1. 3. 8 ELISA 方法與 HI 試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室收集的 120
份臨床樣品用 HI 試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)， 分別用 3 個(gè)血
清型的 HA 抗原進(jìn)行檢測(cè)， 方法如下［7］ : 用血清稀釋
液將吸附后的血清作 2 倍系列稀釋， 第 1 孔為 1∶ 5，
第 2 孔為 1∶ 10， 依此類推， 共作 8 個(gè)稀釋度( 1∶ 5，
1∶ 10， 1∶ 20， …， 1∶ 640) ， 每孔含有 50 μL 稀釋血清。
在各管中加入 4 個(gè) HA 單位的 HA 抗原 50 μL， 充分
混勻后在室溫作用 20 min， 然后每管加入 1% 雞紅細(xì)
胞 50 μL， 充分混勻后在室溫靜置 60 min， 判定結(jié)
果， 以全抑制 HA 的血清最高稀釋度為血清的 HI
效價(jià)。若試驗(yàn)血清的 HI 效價(jià)≥5， 即判為陽性。
recipe代 recipe代 recipe代 recipe北京試劑 recipe天津試劑 recipe上海試劑 recipe代廣東試劑 recipe 代南京試劑 recipe代湖北試劑 recipe代湖南試劑 recipe代黑龍江試劑 recipe代吉林試劑 recipe代上海試劑 recipe代廣州試劑 recipe系列全 recipe系列全 recipe系列全 recipe降價(jià) recipe其他試劑 recipe其他試劑 recipe降價(jià) recipe降價(jià) recipe降價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe活動(dòng)價(jià) recipe降價(jià) recipe降價(jià) recipe降價(jià) recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe試劑 recipe北京現(xiàn)貨 recipe天津現(xiàn)貨 recipe河北現(xiàn)貨 recipe河南現(xiàn)貨 recipe廣東現(xiàn)貨 recipe廣州現(xiàn)貨 recipe上海現(xiàn)貨 recipe湖北現(xiàn)貨 recipe湖南現(xiàn)貨 recipe內(nèi)蒙古現(xiàn)貨 recipe山西現(xiàn)貨 recipe山東現(xiàn)貨，618周年慶， recipe降價(jià) recipe降價(jià) recipe降價(jià)，歡迎選購 recipe 湖北試劑 recipe 湖北試劑
以下RECIPE 系列，一直現(xiàn)貨，價(jià)格美麗，RECIPE 擁有很多忠實(shí)用戶 RECIPE 擁有很多忠實(shí)用戶 RECIPE 擁有很多忠實(shí)用戶 RECIPE 選購 RECIPE 選購 RECIPE 選購
RECIPE 現(xiàn)貨 大力回饋新老客戶，現(xiàn)貨打折出售，現(xiàn)有品牌和種類，新老客戶可以自由選購： RECIPE 北京試劑 RECIPE 常見問題與解答 RECIPE 上海試劑 RECIPE 試劑 RECIPE 廣東試劑 RECIPE 深圳試劑 RECIPE 河北試劑 RECIPE 上海試劑 RECIPE 上海試劑 RECIPE 安徽試劑 RECIPE 河南試劑 tissue.Transnetyx天津試劑 RECIPE 代理， RECIPE 上海試劑 RECIPE 廣東試劑RECIPE 廣州試劑RECIPE 深圳試劑RECIPE 內(nèi)蒙古試劑 RECIPE 河南試劑 RECIPE 江蘇試劑 RECIPE 江西試劑RECIPE 湖北試劑RECIPE 湖南試劑RECIPE 安徽試劑RECIPE 蘇州試劑 RECIPE 杭州試劑RECIPE 浙江試劑 RECIPE 北京 RECIPE 制劑存儲(chǔ) RECIPE 江蘇試劑 RECIPE 浙江試劑 RECIPE 江蘇試劑 RECIPE 江蘇試劑 RECIPE 廣州試劑 RECIPE 試劑選購 RECIPE 試劑選購